盐生杜氏藻（Dunaliellasalina）是一类单细胞海藻，无细胞壁，是只有一层膜包被的原生质体结构。盐藻作为耐盐模式生物，其短时间耐盐方式已有深入了解，主要是离子泵调节和甘油合成，但长时间盐胁迫下，相关基因被诱导表达及信号通路被激活的具体过程仍不清楚。Rab蛋白是小G蛋白家族中最大的亚家族，作为分子开关，在细胞骨架的重组、胞内囊泡的转运、细胞的增值、信号传导等重要的细胞生理活动中起关键作用。
目前已在多种生物中发现了耐盐相关的Rab蛋白。研究盐藻中Rab蛋白，对揭秘盐藻应答盐胁迫过程的分子机制有重要意义。
本实验的研究方法与结果如下：1．将DsRab蛋白基因的开放阅读框连接入带有GST标签的原核表达载体pGS-21a，构建原核表达重组载体pGS-21a-DsRab。将DsRab的编码序列与带有绿色荧光蛋白（GFP）基因载体pMDCMGN连接，构建亚细胞定位载体pMDCGGN。DsRab开放阅读框与植物表达载体pBI121连接，构建植物表达载体pBI121-DsRab。
将构建好的原核表达重组载体pGS-21a-DsRab导入表达菌BL21(DE3)中进行原核表达及表达形式分析，融合蛋白成功表达并以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在。对温度、诱导剂浓度等表达条件进行优化，在28℃，0.01mol/LIPTG诱导培养下，上清中融合蛋白表达量最大。利用GST标签蛋白纯化柱纯化上清中融合蛋白。经Westernblot鉴定该融合蛋白与抗GST的单克隆抗体有特异的免疫原性，初步证明该融合蛋白为GST-DsRab。
将构建成功的亚细胞定位重组载体pMDCGGN转化农杆菌LBA4404感受态细胞，筛选阳性单克隆，采用农杆菌介导法转染洋葱内表皮细胞，荧光显微镜下观察DsRab瞬时表达，发现融合蛋白GFP-DsRab在洋葱内表皮细胞中表达，并且主要分布于膜上。本实验成功构建了，原核表达重组载体pGS-21a-DsRab，亚细胞定位重组载体pMDCGGN和植物表达重组载体PBI121-DsRab。经原核表达及纯化后获得了较纯的可溶性融合蛋白。DsRab在洋葱内表皮细胞中主要分布于膜上。该实验为进一步研究DsRab蛋白，筛选该蛋白在信号通路中的上下游互作蛋白做准备，也为研究该蛋白对高等转基因植物耐盐能力的影响奠定基础。
【关键词】：盐藻Rab蛋白 载体构建 原核表达 亚细胞定位
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